Question

7．为增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将酶D基因与位于叶绿体膜上的转运肽基因相连，导入油菜细胞并获得了转基因油菜品种．

（1）研究人员依据基因的已知序列设计引物，从陆地棉基因文库中获取酶D基因，并采用PCR法大量扩增．从拟南芥基因文库中获取转运肽基因，所含三种限制酶的切点如图所示，则用（ClaI/SacI/XbaI）限制酶和ClaⅠDNA连接酶处理两个基因后，可得到A、D端（填图中字母）相连的融合基因．
（2）将上述融合基因插入图所示Ti质粒的T-DNA中，构建基因表达载体并导入农杆菌中．将获得的农杆菌接种在含四环素的固体平板上培养得到含融合基因的单菌落，再利用液体培养基震荡培养，可以得到用于转化的侵染液．
（3）剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间，此过程的目的是利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞，进一步筛选后获得转基因油菜细胞，该细胞通过植物组织培养技术，可培育成转基因油菜植株．
（4）用抗原-抗体杂交法可检测转基因油菜植株中的融合基因是否成功表达．

Answer 1

分析 1、基因文库包括cDNA文库、基因组文库等．某个群体包含一种生物所有的基因的文库叫基因组文库，而用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA片段属于cDNA文库．
2、限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性．同种限制酶切割能够产生相同的黏性末端，便于质粒和目的基因连接．

解答 解：（1）研究人员依据基因的已知序列设计引物，采用PCR法从陆地棉基因文库中获取酶D基因，从拟南芥基因文库中获取转运肽基因．在上述引物设计时，分别在引物中加入如图甲所示酶的识别序列，这样可以用ClaⅠ限制酶和DNA连接酶处理两个基因后，得到A、D端相连的融合基因．
（2）将上述融合基因插入图乙所示Ti质粒的T-DNA中，构建表达载体即重组质粒并导入农杆菌中．将获得的农杆菌接种在含四环素的固体平板上培养得到单菌落．
（3）剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间，此过程的目的是利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞．
（4）检测目的基因是否成功表达，应该采用抗原-抗体杂交法．
故答案为：
（1）PCR   ClaⅠDNA连接   A、D  
（2）基因表达载体      四环素
（3）利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞
（4）抗原-抗体杂交

点评 本题以增加油菜种子的含油量为材料背景，考查基因工程的相关知识，要求考生能够掌握目的基因获取的方法，能够结合图解中限制酶切点选择合成的工具酶获得融合基因，同时掌握目的基因导入受体细胞以及目的基因检测与鉴定的方法等．