Question

固定化酵母在发酵生产中得到了广泛应用．研究表明用2%海藻酸钠与4%的氯化钙所制得的固定化细胞能够达到最佳的效果．海藻酸钙能与柠檬酸钠反应，而被溶解．某研究小组为了探究固定化酵母菌与游离酵母增殖速率．请协助完成相关研究：
实验材料：干酵母粉、灭菌的酵母菌培养液、灭菌的固定化酵母增殖培养液、海藻酸钠、4%氯化钙溶液、5%柠檬
酸钠溶液、血球计数板，显微镜、蒸馏水
实验步骤：
①酵母菌的活化：在无菌条件下，向装有10mL酵母菌培养液的试管中接种适量的酵母，在28'C下培养48h后，离心取沉淀，再用无菌生理盐水稀释成较高浓度的菌悬液．
②固定化酵母细胞的制备：配制2%每藻酸钠溶液，灭菌冷却→

 

→用注射器造粒（直径约为3mm珠状颗粒）→常温下固定36h．
③固定化酵母的增殖：待固定化结束后，倒去CaCl₂溶液，用无菌水洗涤2～3次；再将固定化凝胶珠分成两等份，取其中一份加到固定化酵母增殖培养液中，在28℃下振荡培养24h，得到固定化增殖酵母，
④固定化酵母增殖测定：将

 

放入一定体积的5%柠檬酸钠溶液中，振荡使凝胶珠完全溶解；再

 

后，用血球计数板计数凝胶球内包埋的菌数，比较酵母菌在载体中生长状况．
回答下列问题：
（1）完善实验步骤：
A．

 

B．

 

C．

 

（2）实验制作的凝胶珠直径不宜过大，这是因为凝胶珠直径过大

 

，实验中可以通过

 

对凝胶珠的大小进行控制．
（3）在将凝胶珠接种到酵母增殖培养液中之前，需要对凝胶珠用无菌水洗涤，其目的是

 

（4）为减少对培养液酵母菌数量测量的误差，应如何进行？

 

（5）试以固定化酵母为材料提出一个研究课题．

 

．

Answer 1

考点：制备和应用固相化酶

专题：

分析：制作固定化酵母细胞的实验步骤：1、酵母细胞的活化； 2、配制0.05mol/L的CaCl₂溶液； 3、配制海藻酸钠溶液 （该实验成败的关键步骤）；4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合； 5、固定化酵母细胞．
固定化酶的优点有：可多次使用、便于产物分离、提高产品质量等．酵母细胞的活化→配制CaCl₂溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母菌细胞．②物理吸附法、①化学结合法、③包埋法；制备固定化酵母细胞，常用的包埋材料是海藻酸钠，使用方法如图③．固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法．一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化．这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出．

解答： 解：（1）固定化酵母细胞的制各：配制2%每藻酸钠溶液，灭菌冷却→A将酵母悬液与海藻酸钠溶液按一定比例均匀混合→用注射器造粒（直径约为3mm珠状颗粒）→常温下固定36h．
固定化酵母增殖测定：将B等量增殖前后的固定化酵母凝胶珠放入一定体积的5%柠檬酸钠溶液中，振荡使凝胶珠完全溶解；再C用无菌水适当稀释后，用血球计数板计数凝胶球内包埋的菌数，比较酵母菌在载体中生长状况．
（2）在将凝胶珠接种到酵母增殖培养液中之前，需要对凝胶珠用无菌水洗涤，其目的是防止凝胶固定的时间过长，使凝胶珠硬度过大，影响凝胶珠的通透性．
（3）胶珠直径不宜过大，这是因为凝胶珠直径过大凝胶珠的相对表面积减少）不利于固定化酵母与外界进行物质交换．实验中可以通过控制注射器的针尖的大小对凝胶珠的大小进行控制．
（4）重复取样品液进行显微计数减少对培养液酵母菌数量测量的误差．
（5）酵母细胞固定化发酵后的性能；酵母固定化对酵母菌最适培养温度提出研究课题．
故答案为：
（1）A将酵母悬液与海藻酸钠溶液按一定比例均匀混合    B等量增殖前后的固定化酵母凝胶珠    C用无菌水适当稀释
（2）（凝胶珠的相对表面积减少）不利于固定化酵母与外界进行物质交换     控制注射器的针尖的大小
（3）防止凝胶固定的时间过长，使凝胶珠硬度过大，影响凝胶珠的通透性．
（4）重复取样品液进行显微计数
（5）酵母细胞固定化发酵后的性能；酵母固定化对酵母菌最适培养温度

点评：本题考查了制备和应用固相化酶的相关知识，要求考生能够识记制作固定化酵母细胞的实验步骤，识记其中的关键步骤；能够从比较表格中得出相应的实验结论，难度适中．