Question

【题目】乳糖酶是一种生物酶制剂，主要用来治疗乳糖不耐受症。研究人员利用基因工程技术，将人工优化的米曲霉乳糖酶基因（lacA）导入乳酸克鲁维酵母细胞，获得了高效表达乳糖酶的重组菌株。下图1为载体PKLACl的限制酶切图谱（总长度为9091bp，bp表示碱基对；XhoⅠ、BglⅡ、SacⅡ表示限制酶，数字代表碱基的编号），amdS基因编码的乙酰胺酶能够将乙酰胺降解成氨，只有转化成功的乳酸克鲁维酵母才能在乙酰胺作为唯一氮源的培养基中生长。图2为含有lacA的DNA片段。

请回答下列问题：

（1）米曲霉合成并分泌至胞外的乳糖酶能将乳糖分解为________。

（2）优化后的米曲霉乳糖酶基因片段lacA中G-C碱基含量由原来的51.4%降低到39.2%，使乳酸克鲁维酵母偏爱的密码子出现的频率大幅度增加，从而在不改变乳糖酶________序列的前提下，提高了重组菌株该基因表达中________（填具体步骤）的效率。

（3）将优化的米曲霉乳糖酶基因片段lacA与pKLACl分别使用用XhoⅠ、BelⅡ双酶切，然后用________连接,得到含目的基因的重组质粒（pKLAC1—lacA，长度为12040bp）。若目的基因置换了pKLACl中一段长33bp的片段，则目的基因的长度为________bp.

（4）用小剂量质粒提取试剂盒提取重组质粒，对所提取的重组质粒用SacⅡ单酶切后纯化，纯化产物用1%琼脂凝胶进行电泳检测。若结果如图3中的第________（填序号）泳道所示，则说明优化后的目的基因片段lacA成功构建在质粒pKLACl中。

（5）将重组质粒pKLACl-lacA用SacⅡ单酶切使其线性化，纯化后与感受态乳酸克鲁维酵母细胞混合、转化。用________适当稀释细胞液，均匀地涂布于________平板上进行培养，富集并筛选重组菌株。将筛选出的重组菌株进行发酵培养120h，检测________，最终获得高效表达乳糖酶的重组菌株。

Answer 1

【答案】葡萄糖和半乳糖 氨基酸 翻译 DNA连接酶 2982 1、3 无菌水 以乙酰胺作为唯一氮源 乳糖酶活性/活力

【解析】

基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）乳糖由葡萄糖和半乳糖组成，故乳糖酶能将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。

（2）乳糖酶的化学本质是蛋白质，优化后的米曲霉乳糖酶基因片段lacA中G-C碱基含量由原来的51.4%降低到39.2%，使乳酸克鲁维酵母偏爱的密码子出现的频率大幅度增加，从而在不改变乳糖酶氨基酸序列的前提下，提高了重组菌株该基因表达中翻译的效率。

（3）乳糖酶基因片段lacA与pKLACl分别使用XhoⅠ、BelⅡ限制性酶酶切，然后用DNA连接酶连接，得到含目的基因的重组质粒。题干信息可知，载体PKLACl的限制酶切图谱总长度为9091bp，含目的基因的重组质粒（pKLAC1—lacA，长度为12040bp）。若目的基因置换了pKLACl中一段长33bp的片段，则目的基因的长度为12040909133=2982bp。

（4）重组质粒，用SacⅡ单酶切后，形成两个大小不同的DNA片段，结合图3，M是marker组，1、2、3号是酶切组，对比分析结果第1、3泳道所示，说明优化后的目的基因片段lacA成功构建在质粒pKLACl中。

（5）防止污染用无菌水适当稀释细胞液，均匀地涂布于以乙酰胺作为唯一氮源平板上进行培养，富集并筛选重组菌株。将筛选出的重组菌株进行发酵培养120h，检测乳糖酶活性/活力，最终获得高效表达乳糖酶的重组菌株。