Question

【题目】苯丙酮尿症是PKU基因突变引起，研究人员尝试用基因治疗的方式治疗该疾病，即将正常基因D导入携带有突变基因的细胞中。下图中的图甲为A、B、C三种质粒，图乙为含有目的基因 D的DNA片段，图丙表示重组载体的示意图。其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ 为蓝色显色基因（基因表达的产物将无色化合物X-gal转化成一种蓝色物质，菌落呈蓝色），EcoRⅠ（0.7Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）等为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离。已知 1 Kb＝1 000 个碱基对。请结合所学知识回答：

（1）将正常的D基因导入受体细胞的基因工程操作步骤中，其核心是________，据图分析上述甲图中三种质粒中不宜作为运载体的有________，请分析原因________。

（2）若要获取目的基因D，上述乙图中应选择限制酶________对其所在的DNA进行切割。如果仅知道D基因首尾的部分核苷酸序列，通常可根据该基因首尾两端的已知核苷酸序列合成________，利用________技术得到大量目的基因。

（3）将目的基因 D 和甲图中可做载体的质粒进行连接后，会得到图丙中三种连接方式。需要选出正向连接的重组质粒，可使用________酶切割所获得的重组质粒。完全酶切后，进行电泳分析。若是载体自连，电泳图谱中出现 2.7Kb 一条带，若是正向连接载体和反向连接载体，电泳图谱中出现长度分别为________和________。

（4）选择自身不含lacZ基因且对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，在已转化的含重组质粒、空质粒的受体细胞中和未转化成功的细胞中如何筛选出成功导入重组质粒的受体细胞_______________。

Answer 1

【答案】基因表达载体的构建 AC 质粒A缺少标记基因，质粒C复制原点被限制酶切割 PvuⅠ 引物 PCR EcoRⅠ 1.1Kb和5.6Kb 3.1Kb和3.6Kb 在含有氨苄青霉素的加入X-gal培养基上培养经转化后的细胞，形成白色菌落的即为导入重组质粒的受体细胞，蓝色菌落的没有导入重组细胞

【解析】

分析图甲：质粒A含有EcoRⅠ和PvuⅠ限制酶割位点，无标记基因；质粒B含有中Ap基因和lacZ基因，且EcoRⅠ和PvuⅠ限制酶切位点位于lacZ基因内；质粒C含有中Ap基因和Tc基因，含有EcoRⅠ和PvuⅠ限制酶割位点，PvuⅠ限制酶割位点位于复制原点。

（1）基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤，其中基因工程的核心是基因表达载体的构建。图中质粒A缺少标记基因；质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被限制酶切割，会影响重组质粒的自主复制。因此，不能作为目的基因运载体的质粒是A、C。

（2）分析乙图，目的基因D上有两个PvuⅠ酶切位点和一个EcoRⅠ酶切位点，而EcoRⅠ酶切会破坏目的基因D的结构，因此应选用PvuⅠ酶对其所在的DNA进行切割。利用PCR扩增技术可以获得大量的目的基因，用PCR扩增基因之前，需要先根据该基因已知核苷酸序列制出相应的引物。

（3）在目的基因上存在EcoRⅠ酶的切割位点，因此在基因工程的操作过程中，需要选出正向连接的重组质粒，应使用该酶切重组质粒。依题意和图甲、乙可知，由于目的基因D的长度为4.0Kb，因此用质粒B构建的重组质粒的长度为4.0Kb+2.7Kb=6.7Kb，重组质粒被EcoRⅠ酶完全切割后，出现两个不同长度片段，若是正向连接（目的基因D上的EcoRⅠ酶切位点与质粒B上的EcoRⅠ酶切位点的距离最近），会得到0.1Kb+1.0Kb=1.1Kb和（2.7Kb+4.0Kb）-1.1Kb=5.6Kb的两个片段；若是反向连接（目的基因D上的EcoRⅠ酶切位点与质粒B上的EcoRⅠ酶切位点的距离较远），会得到0.1Kb+3.0Kb=3.1Kb和（2.7Kb+4.0Kb）-3.1Kb=3.6Kb的两个片段。

（4）在含有氨苄青霉素的加入X-gal培养基上培养经转化后的细胞，导入重组质粒的受体细胞，质粒上lacZ基因被破环，不能将无色化合物X-gal转化成蓝色物质，且质粒中含有Ap基因，故受体菌能在培养基上正常生长，形成白色菌落；导入空质粒的受体细胞，具有Ap基因和lacZ基因，故能在培养基上生长，且能将无色化合物X-gal转化成蓝色物质，菌落呈蓝色；未转化成功的细胞中不含Ap基因，故不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。