Question

【题目】人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但是大剂量使用会诱发颅内出血。如果将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。下图表示通过重叠延伸PCR技术获取t-PA改良基因和构建含t-PA改良基因重组质粒的过程示意图。图中重叠延伸PCR过程中，引物a、b被用来扩增含有突变位点及其上游序列的DNA片段，引物c、d被用来扩增含突变位点及其下游序列的DNA片段。请回答：

（1）已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点表示突变部位的碱基，引物b中该部位的碱基是______，引物c该部位的碱基是______。PCR中需要引物的原因是______。

（2）重叠延伸PCR中，PCR1和PCR2分别进行，产物混合后再进行PCR3。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是______。

（3）构建重组质粒时，选用的限制酶是______。重组质粒中的新霉素抗性基因的作用是______。

（4）在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株，需选择呈______色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良t-PA蛋白的工程菌株。上述生产改良t-PA蛋白的技术属于______工程。

Answer 1

【答案】G C DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链 引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效 XmaⅠ和BglⅡ 便于将导入质粒的大肠杆菌筛选出来 白 蛋白质

【解析】

基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。也就是说，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。

（1）已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。由此可知基因模板链第84为发生碱基替换为ACA→AGA，即t-PA基因的上链中相应位置的ACA→AGA，图中显示引物b与t-PA基因的下链互补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是G，引物c与t-PA基因的上链互补，故其中相应部位的碱基与下链相同，即该部位的碱基是C，由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，因此 PCR中需要加入合适的引物来完成子链延伸。

（2）图中信息显示，引物b和引物c可以互补配对，因此，如果PCR1和PCR2同时进行，无法达到预期目的。

（3）根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒，才能与目的基因t-PA改良基因高效连接。在构建重组质粒时，其中的新霉素抗性基因没有被破坏，因此可以根据对新霉素的抗性将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，即该基因的作用是便于将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来。

（4）在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞应该包含两种类型，一类是导入质粒的大肠杆菌，这类大肠杆菌细胞因为含有mlacZ基因而呈蓝色；一类是导入重组质粒的大肠杆菌，因为其中不含mlacZ基因，该细菌表现为白色，因此需选择呈白色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良t-PA蛋白的工程菌株。上述生产改良t-PA蛋白的技术属于蛋白质工程。