Question

【题目】Sanger法DNA测序的核心原理：由于双脱氧核苷酸（ddNTP）五碳糖的2'和3'碳原子都不含羟基，在DNA合成过程中不能形成“相应化学键”，因此可中断DNA分子合成反应。在四个含有4种脱氧核苷酸（dNTP）的PCR反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的 ddNTP（分别为ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），在PCR过程中复制随机终止，产生四组不同长度的一系列终止处带有标记的DNA片段，如图1。然后在变性凝胶上进行电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列，具体过程见下图2。（注：ddA是ddATP的缩写形式）

（1）题干中“相应化学键”是_____，图1过程Ⅰ横线①处加入的物质的特点是________，该过程需要添加引物的原因是______________________。

（2）题干中“在变性凝胶上进行电泳……”中“变性”是指__________，其目的是_________________。

（3）某同学要通过PCR技术获得被32P标记且以碱基“C”为末端、不同长度的子链DNA片段，在反应管中已有模板、引物、酶和相应缓冲液等，还需加入的原料有__________________。

（4）若模板链是“ 3' …TCAGCTCGAATC…5' ”，变性后电泳结果如图2所示，则模板DNA电泳后所处的位置最可能为____（选填“a处”或“b处”），原因是__________。

Answer 1

【答案】磷酸二酯键 耐高温 DNA聚合酶只能将游离的脱氧核苷酸添加到已有核酸片段上 破坏DNA分子中氢键，获得单链 避免模板链对结果的影响（或使模板链与子链分离，使电泳结果直接反映子链的长度，便于读序） dATP、dGTP、dTTP、dCTP 、ddCTP b处 模板DNA长度最长（分子量最大）

【解析】

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。PCR的过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。

（1）DNA分子合成是以DNA的两条链为模板，以游离的脱氧核苷酸为原料，合成子链，题干中“相应化学键”是磷酸二酯键，连接脱氧核苷酸成子链。图1过程Ⅰ横线①处加入的物质为TaqDNA聚合酶，特点是耐高温。该过程需要添加引物的原因是DNA聚合酶只能将游离的脱氧核苷酸添加到已有核酸片段上，需由引物先跟模板结合。

（2）PCR是体外合成DNA的方式，“变性”是指破坏DNA分子中氢键，获得单链。其目的是避免模板链对结果的影响（或使模板链与子链分离，使电泳结果直接反映子链的长度，便于读序）。

（3）在反应管中已有模板、引物、酶和相应缓冲液等，还需加入的原料有dATP、dGTP、dTTP、dCTP 、ddCTP，那么子链会在碱基“C”的地方停止合成。

（4）若模板链是“ 3' …TCAGCTCGAATC…5' ”，变性后电泳结果如图2所示，则模板DNA电泳后所处的位置最可能为b处，原因是模板DNA长度最长（分子量最大）。