Question

【题目】为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。请回答问题：

（1）科学家是利用RT-PCR技术（mRNA逆转录为cDNA再进行PCR扩增），获得花色基因C，RT-PCR过程需要的酶有_____。在进行PCR扩增时需要设计___种引物。

（2）将基因C与质粒（图2）重组，需要用到的酶有_____。本实验中，对质粒进行酶切时，只能单一酶切，不能双酶切，原因是____________________。与双酶切相比，单一酶切存在的缺点是________________（答出两点）。

（3）把重组质粒导入菊花细胞中，借助了农杆菌，选用农杆菌的原因是___________。

（4）在实验操作过程中，筛选被转化的菊花细胞应在培养基中添加_________。如要检测基因C是否整合到菊花染色体的DNA上，应采用__________技术。

Answer 1

【答案】逆转录酶和Taq酶（热稳定的DNA聚合酶） 2 EcoRI和DNA连接酶 基因C只有EcoRI的酶切位点，当质粒被同一种酶切割后产生同样的末端，基因C才能和质粒连接成环状 目的基因会自身连接、载体会自身连接、目的基因与运载体反向连接（任意两点） 能感染菊花细胞、农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可以转移至菊花细胞，且能整合到菊花细胞染色体DNA上 潮霉素 DNA分子杂交

【解析】

1、有关PCR技术的相关知识：

（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。

（2）原理：DNA复制。

（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。

（4）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。

2、基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）根据题意可知，RT-PCR技术是mRNA逆转录为cDNA再进行PCR扩增的过程，其中逆转录过程需要逆转录酶，而PCR技术需要Taq酶（热稳定的DNA聚合酶）的催化。在进行PCR扩增时需要设计两种引物。

（2）将基因C与质粒重组，需要用到的酶有EcoRI和DNA连接酶。本实验中，对质粒进行酶切时，只能单一酶切，不能双酶切，原因是基因C只有EcoRI的酶切位点，当质粒被同一种酶切割后产生同样的末端，基因C才能和质粒连接成环状。与双酶切相比，单一酶切存在的缺点是目的基因会自身连接、载体会自身连接、目的基因与运载体反向连接。

（3）借助了农杆菌把重组质粒导入到植物细胞，因为农杆菌能感染菊花细胞、农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可以转移至菊花细胞，且能整合到菊花细胞染色体DNA上。

（4）图2中显示标记基因是潮霉素抗性基因，因此可在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的菊花细胞。检测目的基因是否导入受体的细胞常用DNA分子杂交技术。