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    4．如图1为某种常用质粒的序列图，LacZ基因编码的酶能使无色的X-gal变为蓝色，Ampr为氨苄青霉素抗性基因．图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列．请回答下列问题：

    （1）若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有X-gal和氨苄青霉素．基因表达载体的组成除了目的基因外，还必须有启动子、终止子和标记基因等．对获取的目的基因可用PCR（多聚酶链式反应）技术对其扩增．
    （2）实验小组用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割目的基因和质粒，构建重组质粒后导入大肠杆菌中，在筛选重组质粒的培养基上，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入了没有目的基因的空质粒；若大肠杆菌菌落显白色，说明导入了重组质粒．没有导入任何外源DNA的大肠杆菌不能（填“能”或“不能）在该培养基上生存．
    （3）将若干个质粒和目的基因用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割后，用DNA连接酶相连，若仅考虑质粒与目的基因相连接，会有两种连接方式．然后再用BamHⅠ和EcoRⅠ切割成功连接后的产物，获得了长度为0.8kb、3.8kb、1.1kb和3.5kb四种长度的DNA片段，则目的基因的长度为2.7kb（已知目的基因的长度大于2kb，1kb=1000个碱基对）．

    分析 分析题图：质粒中，抗氨苄青霉素抗性基因（Amp'）和LacZ基因都属于标记基因，含有目的基因的外源DNA分子上存在BamHⅠ和BlgⅡ两种酶的酶切位点，质粒上存在BamHⅠ和EcoRⅠ两种酶的酶切位点．一般为了防止目的基因和质粒反向连接，用两种限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和质粒．

    解答 解：（1）由于Lac Z基因编码的酶能使无色的X-gal变为蓝色，Amp为氨苄青霉素抗性基因，所以若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有X-gal和氨苄青霉素．基因表达载体的组成包括启动子、标记基因、目的基因和终止子．PCR技术可在体外对目的基因进行扩增．
    （2）构建重组质粒后导入大肠杆菌中，在筛选重组质粒的培养基上，由于Lac Z基因编码的酶能使无色的X-gal变为蓝色，若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入的是不含目的基因的空白质粒．若大肠杆菌菌落显白色，说明Lac Z基因被破坏，不能编码相应的酶，所以导入的是重组质粒．没有导入任何外源DNA的大肠杆菌不含氨苄青霉素抗性基因，所以不能在该培养基上生存．
    （3）BamHⅠ和BlgⅡ两种酶识别的序列为G↓GATCC、A↓GATCT，它们的识别序列虽然不同，但切割形成的黏性末端相同，因此将若干个质粒和目的基因用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割后，用DNA连接酶相连，若仅考虑质粒与目的基因相连接，会有两种连接方式，即正向连接和反向连接．用BamHⅠ切割和EcoRⅠ切割成功连接后的产物，获得了长度为获得了长度为0.8kb、3.8kb、1.1kb和3.5kb四种长度的DNA片段，这说明重组质粒的总长度为0.8kb+3.8kb=4.6．由于目的基因的长度大于2kb，若正向连接时，BamHⅠ切点与EcoRⅠ切点之间的距离为3.8kb，则质粒中EcoRⅠ切点到BamHⅠ切点之间距离为0.8kb（含有Ampr的一段）．反向连接时，质粒中EcoRⅠ切点到BamHⅠ切点之间距离（含有Ampr的一段）+目的基因的长度=3.5kb．因此，目的基因的长度为3.5-0.8=2.7kb．
    故答案为：
    （1）X-gal     氨苄青霉素     启动子      PCR（多聚酶链式反应）
    （2）没有目的基因的空质粒     重组质粒       不能
    （3）两     2.7

    点评 本题结合重组质粒形成示意图，考查基因工程的相关知识，重点考查基因工程的步骤，要求考生识记基因工程的步骤，掌握重组质粒的筛选方法，能运用所学的知识，结合题图，判断导入重组质粒的大肠杆菌能否在相应的培养基中生存．

    练习册系列答案
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    A．B．
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