Question

【题目】科研人员培育了一种能够降解餐厨废弃物并生成乳酸的转基因毕赤酵母。基本思路是在乳酸脱氢酶基因（LDH）的单基因表达载体中逐个接入糖化酶基因（Ga）表达盒与α-淀粉酶基因（Amy）表达盒，构建出AGL-三基因表达载体，如图1所示：（ori为复制原点；ZeocinR为博来霉素抗性基因；）LDH-单基因表达载体①②GL-二基因表达载体AGL-三基因表达载体oriZeocinRLDHAmyGaBglⅡBamHⅠA．糖化酶基因表达盒BglⅡBamHⅠB．α-淀粉酶基因表达盒BglⅡBamHⅠ③C④D．基因重组毕赤酵母E．表达检测。

（1）获取目的基因：利用PCR技术获得目的基因的过程中，需要在PCR反应体系中加入模板、Taq酶及______。

（2）将图1所示结构“导入”毕赤酵母后，要筛选出含有三基因表达载体的毕赤酵母的操作思路是：______。

（3）对筛选出的菌株进行进一步鉴定的方法有：______（写出一种）。利用转基因毕赤酵母降解餐厨废弃物生成乳酸，既减少了环境污染，也降低了乳酸的生产成本，这符合生态工程中的______原理。

（4）构建三基因表达载体的难点在于构建目的基因的表达盒，图2LDH-单基因表达载体①②GL-二基因表达载体AGL-三基因表达载体oriZeocinRLDHAmyGaBglⅡBamHⅠA．糖化酶基因表达盒BglⅡBamHⅠB．α-淀粉酶基因表达盒BglⅡBamHⅠ③C④D．基因重组毕赤酵母E．表达检测为构建α-淀粉酶基因表达盒的示意图（糖化酶基因表达盒构建与之类似，此处省略）。

注：pro为启动子；AOXTT为终止子；Bsp119Ⅰ、XbaⅠ、BglII、BamHⅠ为四种限制酶）LDH-单基因表达载体①②GL-二基因表达载体AGL-三基因表达载体oriZeocinRLDHAmyGaBglⅡBamHⅠA．糖化酶基因表达盒BglⅡBamHⅠB．α-淀粉酶基因表达盒BglⅡBamHⅠ③C④D．基因重组毕赤酵母E．表达检测

操作的处理是：将质粒1与α-淀粉酶基因均用Bsp119Ⅰ与XbaⅠ两种不同的限制酶处理，然后拼接。与用一种限制酶切相比，优点是______；在此之前，科研人员还利用点突变技术对α-淀粉酶基因序列进行了同义密码子替换（即不影响氨基酸序列）改造，推测其原因______。操作中必需用______酶对质粒2处理，才能获得能正常表达的α-淀粉酶基因表达盒。

Answer 1

【答案】引物和四种游离的脱氧核苷酸 将毕赤酵母转移至含博来霉素的培养基中进行培养，筛选出能够生存的菌落即为含有三基因表达载体的毕赤酵母 测定其基因表达产物（酶）的活性；将其接种至餐厨废弃物中，定时测定乳酸的含量 整体性 防止目的基因、质粒1发生自身环化；使质粒1与α-淀粉酶基因以正确的方向进行拼接 α-淀粉酶基因序列中含有所用限制酶的识别序列 BglII、BamHⅠ

【解析】

基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）利用PCR技术获得目的基因的过程中，需要在PCR反应体系中加入模板、Taq酶及引物和四种游离的脱氧核苷酸。

（2）筛选出含有三基因表达载体的毕赤酵母的操作思路是将毕赤酵母转移至含博来霉素的培养基中进行培养，筛选出能够生存的菌落即为含有三基因表达载体的毕赤酵母。

（3）对筛选出的菌株进行进一步鉴定的方法有测定其基因表达产物（酶）的活性；将其接种至餐厨废弃物中，定时测定乳酸的含量。利用转基因毕赤酵母降解餐厨废弃物生成乳酸，既减少了环境污染，也降低了乳酸的生产成本，这符合生态工程中的整体性原理。

（4）将质粒1与α-淀粉酶基因均用Bsp119Ⅰ与XbaⅠ两种不同的限制酶处理，然后拼接。与用一种限制酶切相比，优点是防止目的基因、质粒1发生自身环化；使质粒1与α-淀粉酶基因以正确的方向进行拼接；在此之前，科研人员还利用点突变技术对α-淀粉酶基因序列进行了同义密码子替换（即不影响氨基酸序列）改造，推测其原因α-淀粉酶基因序列中含有所用限制酶的识别序列。操作中必需用BglII、BamHⅠ酶对质粒2处理，才能获得能正常表达的α-淀粉酶基因表达盒。