Question

【题目】某科研小组通过农杆菌转化法将黑麦草的抗旱基因P转入野生型拟南芥，以验证基因P的功能，其流程如图所示。回答下列问题：

（1）利用PCR技术从黑麦草的DNA中分离并克隆目的基因P，______________（填“需要”或“不需要”）用限制酶进行预处理，其原因是_________________________。

（2）用Smal I和Sal I这两种限制酶分别对含有基因P的DNA和质粒进行双酶切，然后连接形成①______________。与双酶切相比，用同一种限制酶对二者进行单酶切的缺点是容易造成基因P或质粒自身环化、______________。

（3）将②的花序浸入农杆菌悬浮液以实现转化，在适宜条件下培养，收获@的种子，在含潮霉素（一种抗生素）的MS培养基上筛选得到③，这表明质粒载体携带的选择标记是______________。

（4）基因P表达的蛋白P是脯氨酸合成过程所需的一种关键酶，而脯氨酸在细胞中的积累既可提高植物的抗旱性，又可抑制蛋白P的酶活性。研究发现，蛋白P的第128位苯丙氨酸若变为丙氨酸，该抑制作用则显著降低。请据此提出进一步提高植物抗旱性的一种简要思路______________。

Answer 1

【答案】不需要 使用基因特异性引物可以从模板DNA中扩增出特定基因 重组质粒（重组DNA分子） 基因P和质粒反向连接 潮霉素抗性基因 定点诱变改造目的基因P，使其编码的蛋白P的第128位苯丙氨酸替换为丙氨酸；将改造后的基因转入受体植物，以期提高受体植物的抗旱性

【解析】

基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。从分子水平上检测目的基因的方法：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。

（1）使用基因特异性引物可以从模板DNA中扩增出位于两个引物之间的特定基因序列，无需限制酶预先切取模板。

（2）目的基因和质粒载体的连接物称为重组质粒或者重组DNA分子。用同一种限制酶对含有目的基因的DNA和质粒进行单酶切，因为获得的末端相同，所以容易造成目的基因或质粒自身环化、目的基因和质粒反向连接。

（3）MS培养基中添加潮霉素进行筛选，由此可见，质粒载体携带的标记基因是潮霉素抗性基因。

（4）蛋白P的第128位苯丙氨酸若变为丙氨酸，脯氨酸抑制蛋白P的酶活性的作用则显著降低。但是，如何将蛋白P的第128位苯丙氨酸变为丙氨酸，这就必须从根本上相应地改造抗旱目的基因P，将改造后的基因转入受体植物，以期提高受体植物的抗旱性。