Question

4．科研人员通过基因工程实现了β-甘露聚糖酶基因在猪肠道野生酵母菌中的表达，使原来不能被猪利用的粗纤维在猪肠道内被分解成可直接吸收的单糖．如图为构建工程菌的部分过程，其中介导序列能引导载体整合到酵母菌的染色体DNA上．请回答：

限制酶	识别序列和切割位点
EcoRⅠ	↓ GAATTC
BamHⅠ	↓ GGATCC
BglⅡ	↓ AGATCT
SalⅠ	↓ GTCGAC

（1）①过程中需要的工具酶是热稳定性DNA聚合酶，②③过程中需要的工具酶是（限制酶和）DNA连接酶．
（2）同尾酶是指切割DNA分子后能产生相同黏性末端的限制酶，图中4种限制酶中属于同尾酶的是BamHⅠ和BglⅡ．
（3）重组表达载体中的介导序列引导目的基因整合到酵母菌的染色体DNA上，其意义在于使目的基因能随工程菌染色体稳定遗传和表达．
（4）①过程从野生酵母菌染色体DNA中PCR扩增介导序列时，科研人员设计了如下一对引物：和 ，其中下划线部分序列的设计依据是介导序列两端的部分DNA序列，方框部分序列的设计目的是使扩增出的介导序列两端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列．
（5）对重组表达载体进行酶切鉴定，假设所用的酶均可将识别位点完全切开．若使用EcoRⅠ和SalⅠ酶切，得到3种DNA片断．若使用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，得到2种DNA片断．

Answer 1

分析 分析题图：图示为构建工程菌的部分过程，其中①表示采用PCR技术扩增介导序列的过程；②是用DNA连接酶将质粒载体与介导序列连接形成重组质粒的过程；③表示用DNA连接酶将质粒载体、介导序列质粒载体和克隆载体重新组成形成重组表达载体．

解答 解：（1）图中①表示采用PCR技术扩增介导序列的过程，该过程在高温条件下进行，需要热稳定性DNA聚合酶；②③表示基因表达载体的构建过程，除了图中的限制酶外，该过程中还需要DNA连接酶．
（2）表中限制酶BamHⅠ和BglⅡ的识别序列不同，但两者切割产生的黏性末端相同，属于同尾酶．
（3）转基因生物染色体的DNA上是否插入目的基因是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键．重组表达载体中的介导序列引导目的基因整合到酵母菌的染色体DNA上，这可使目的基因能随工程菌染色体稳定遗传和表达．
（4）①过程从野生酵母菌染色体DNA中PCR扩增介导序列时，科研人员设计了如下一对引物：GAATTCGACCTCAAATCAGGTAGG和TTGCATTGACTTACACCTAGG，引物是根据已知核苷酸序列设计的，因此其中下划线部分序列的设计依据是介导序列两端的部分DNA序列；GAATTC是限制酶EcoRⅠ的识别序列，而CCTAGG是限制酶BamHⅠ的识别序列，因此方框部分序列的设计目的是使扩增出的介导序列两端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列．
（5）由图可知，重组的基因表达载体含有2个EcoRⅠ酶割位点，含有1个SalⅠ酶切位点，因此使用EcoRⅠ和SalⅠ酶切重组质粒可以得到3种DNA片断．重组的基因表达载体含有2个EcoRⅠ酶割位点，但不再含有BamHⅠ酶割位点，因此用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切重组质粒可以得到2种DNA片断．
故答案为：
（1）热稳定性DNA聚合酶（Taq酶或耐高温的DNA聚合酶）  （限制酶和）DNA连接酶
（2）BamHⅠ和BglⅡ
（3）使目的基因能随工程菌染色体稳定遗传和表达
（4）介导序列两端的部分DNA序列    使扩增出的介导序列两端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列
（5）3    2

点评 本题结合构建工程菌的部分过程图解，考查基因工程的技术和原理，要求考生识记基因工程的工具和操作步骤，能根据图中和表中信息答题．需要注意的是第（5）题，考生可以将重组表达载体上的酶切位点标出，明确BamHⅠ和BglⅡ切割后的黏性末端能在DNA连接酶的作用下连接起来，但重组序列不能被BamHⅠ或BglⅡ酶割．