Question

发光细菌检测法在检测生物毒性的方法中具有灵敏、简便的特点而被广泛采用．
实验原理：细菌代谢正常时，发光细菌的发光强度稳定，并可维持较长时间；当外界环境影响到发光细菌代谢时，发光会立即受到抑制，且抑制程度与影响物质浓度大小呈相关关系．
实验材料：明亮发光杆菌（海水细菌）、待测海水水样、2%的NaCl溶液、3%NaCl溶液、生物毒性测试仪（用于测定细菌发光强度）、全温振荡器、试管等．
Ⅰ．发光细菌的培养
发光细菌可以直接从海水中和海鱼的体表和内脏中分离，所采用的培养基成分为：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，甘油0.3%，KH₂PO₄0.1%，Na₂HPO₄0.5%，NaCI₃%，琼脂2%，pH6.5．
（1）发光细菌为

 

（自养型/异养型）．取海鱼内脏放入灭菌培养皿中20℃培养12-18小时，在暗室中寻找发光点，用

 

刮取少许菌苔，在

 

培养基中采用

 

法获得纯化的发光菌株．使用前接种到

 

培养基中20℃下振荡培养10-12小时，增殖后用磷酸缓冲液稀释后备用．
Ⅱ．海水中重金属污染程度测定
a、配制发光菌悬液；
b、抑光反应：按照下表配置海水样品稀释液；
表1海水中重金属污染程度测定

试管编号	1	2	3	4	5
3%NaCl溶液（mL）		4.74	4.49	4.24	3.99
海水样品（mL）		0.25	0.50	0.75	1.00
发光菌悬液（mL）		0.01	0.01	0.01	0.01
混合液中海水浓度（%）		0.05	0.10	0.15	0.20

（2）表1中1号试管的作用是

 

．
（3）请在表格中填写适当的数据．
（4）利用生物毒性测试仪测定各试管的

 

（测定指标）．
Ⅲ．五氯酚钠毒性测定
资料：五氯酚钠在水中以五氯苯酚阴离子和五氯苯酚分子平衡存在；五氯苯酚比五氯酚钠的极性小得多，更容易通过生物膜而与细菌细胞相接触．实验温度25℃下，pH为6.0、7.0、8.0、9.0时，pH每升高1个单位，分子态五氯苯酚所占的比例就下降一个数量级．
a、将五氯酚钠配成5个左右浓度等级，将接种后12h的菌液1-2mL用20-30mL3%NaCl溶液稀释混合，磁力搅拌10min 后，?取0.2mL加入比色管中，上下振荡5次，去塞，静置15min后用生物毒性测试仪测定发光强度．
b、计算相对发光率
相对发光率（RL）=测试管发光量mV/对照管发光量mV×100%
计算对应相对发光率减小50%的物质浓度（EC50）??
c．不同pH条件下，五氯酚钠毒性测定
发光细菌适宜生存的pH值为6.0-9.0
?表2    不同pΗ 值下五氯酚钠毒性测定结果/㎎?L^-1

pΗ	6.0	7.0	8.0	9.0
EC50值	1.74	2.41	9.39	15.94

（5）表2的结果与结论

 

．
（6）据资料分析可能的原因：

 

．

Answer 1

考点：微生物的利用,培养基对微生物的选择作用

专题：

分析：据实验设计可知，表1中1号试管应为对照组，起对照作用．根据对照原则和等量原则，1号试管中应不加入海水样品，且保持试管中液体相等，故应加入4.99mL3%NaCl溶液及0.01mL发光菌悬液．本实验测定指标可用利用发光率来表示，故可用生物毒性测试仪测定各试管的发光强度．根据表2的结果可知发光细菌在 pH值6.0-9.0间，EC50值随着pΗ值的提高而增大，故说明五氯酚钠对发光细菌的毒性降低．

解答： 解：（1）发光细菌的代谢方式为异养型，接种时可用接种环接种到固体培养基上，通过平板划线法获得纯化的菌株；然后利用液体培养基进行扩大培养．
（2）据实验设计可知，表1中1号试管应为对照组，起对照作用．
（3）根据对照原则和等量原则，1号试管中应不加入海水样品，且保持试管中液体相等，故应加入4.99mL3%NaCl溶液及0.01mL发光菌悬液．
（4）本实验测定指标可用利用发光率来表示，故可用生物毒性测试仪测定各试管的发光强度．
（5）根据表2的结果可知发光细菌在 pH值6.0-9.0间，EC50值随着pΗ值的提高而增大，故说明五氯酚钠对发光细菌的毒性降低．
（6）据资料分析可能的原因为五氯苯酚易通过细胞膜进入细菌，对细菌造成毒性．发光细菌在pH值6.0-9.0间，随着pH升高，分子态五氯苯酚所占的比例就下降，进入细菌细胞的数量减少，因而毒性下降．
故答案为：（1）异养型    接种环    固体    划线法    液体
（2）对照
（3）

试管编号	1
3%NaCl溶液（mL）	4.99
海水样品（mL）	0
发光菌悬液（mL）	0.01
混合液中海水浓度（%）	0

（4）发光强度
（5）发光细菌在 pH值6.0-9.0间，EC50值随着pΗ值的提高而增大，五氯酚钠对发光细菌的毒性降低．?
（6）五氯苯酚易通过细胞膜进入细菌，对细菌造成毒性．发光细菌在 pH值6.0-9.0间，随着pH升高，分子态五氯苯酚所占的比例就下降，进入细菌细胞的数量减少，因而毒性下降．

点评：本题综合考查了微生物的培养、应用和实验探究，意在考查学生的应用和实验设计能力，试题难度中等．