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    【题目】普通棉花中含β-甘露糖苷酶基因（GhMnaA2），其能在纤维细胞中特异性表达，产生的 β-甘露糖苷酶催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育新的棉花品种，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体，利用农杆菌转化法将其导入棉花细胞，成功获得转基因棉花品种，具体过程如下图所示。请分析回答：

    （1）①和②过程中所用的限制性核酸内切酶分别为____________、____________。

    （2）过程①中纤维细胞E6启动子在质粒1上只以一种方向的相连，请解释GhMnaA2基因在质粒2上可以正向和反向两种方向相连的原因是_______________，这种操作的缺点是目的基因容易发生___________，从而影响与质粒的拼接。

    （3）基因表达载体除了图示组成外，至少还有________________________。

    （4）过程③中需用CaCl2处理农杆菌，使其处于______________________态，从而使外源基因容易导入。

    （5）过程④利用农杆菌介导转化棉花细胞的过程，整合到棉花细胞染色体DNA上去的区段是重组质粒中的____________部分。

    （6）导入棉花细胞内的反义GhMnaA2基因转录形成的mRNA能____________，从而阻止____________合成，使棉纤维更长。

    【答案】HindⅢ和 BamHⅠ SmaⅠ 过程②中目的基因和质粒两侧都形成相同的粘性末端 自身环化 复制原点、终止子、标记基因 感受 T-DNA 与棉花细胞内的GhMnaA2转录的mRNA互补配对 β-甘露糖苷酶

    【解析】

    分析题图：①和②过程表示基因表达载体的构建过程，在①过程中，纤维细胞E6启动子前后含有限制酶HindⅢ和BamHⅠ的切割位点，因此可以用这两种酶切割；②是构建GhMnaA2基因表达载体的过程， GhMnaA2基因前后有限制酶SmaⅠ的切割位点，因此可以该酶切割获取目的基因；③是扩增、鉴定、筛选反义表达载体；④是利用农杆菌转化法将重组质粒导入受体细胞；最后采用植物组织培养技术将受体细胞培养形成植物体。

    （1）根据以上分析已知，①过程使用的限制酶是HindⅢ和 BamHⅠ，②过程使用的限制酶是SmaⅠ。

    （2）②过程使用的限制酶是SmaⅠ，导致目的基因和质粒两端都产生了相同的粘性末端，所以GhMnaA2基因在质粒2上可以正向和反向两种方向相连；这种操作的缺点是目的基因容易发生自身环化，从而影响与质粒的拼接。

    （3）基因表达载体的组成成分包括复制原点、目的基因、启动子、终止子和标记基因，而图示基因表达载体只有启动子和目的基因，还缺少复制原点、终止子和标记基因。

    （4）过程③将目的基因导入农杆菌时，需要用氯化钙处理农杆菌，使之处于感受态，易于外源基因（目的基因）的导入。

    （5）农杆菌介导转化棉花细胞的过程中，整合到棉花细胞染色体DNA的区段是重组质粒中含有E6启动子和GhMnaA2基因的T-DNA。

    （6）导入细胞内的反义GhMnaA2转录的mRNA能与细胞内的GhMnaA2转录的mRNA互补配对，从而抑制基因的表达的翻译过程，阻止β-甘露糖苷酶合成，使棉纤维更长。

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