Question

15．在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因A控制合成的抗冻蛋白A有较好的应用价值，通过转基因技术获得抗寒能力提高的植株．回答有关问题：
（1）从深海鱼提取和纯化DNA时，选择NaCl溶液的合适浓度，利用DNA和其它杂质在不同NaCl溶液中溶解度不同的特性，达到分离目的，加入一定量可以进一步获得含杂质较少的DNA．
（2）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生末端．若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生黏性末端的限制酶．
（3）为了检测A基因转录的mRNA是否翻译成抗冻蛋白A，需从转基因生物提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原抗体杂交．
（4）若要用动物细胞工程技术，制备抗A抗体的杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞，并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞按一定比例加入试管中，再加入诱导细胞融合．细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有，体系中出现多种类型细胞的原因是细胞融合是随机的，且融合率达不到100%．

Answer 1

分析 基因工程的操作步骤为：
第一步：目的基因的获取
（1）目的基因是指：编码蛋白质的结构基因．
（2）原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成．人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法．
（3）PCR技术扩增目的基因
第二步：基因表达载体的构建
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用．
（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因
第三步：将目的基因导入受体细胞
（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程．
（2）常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等．
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术．此方法的受体细胞多是受精卵．
将目的基因导入微生物细胞：Ca²⁺转化法．
（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达．
第四步：目的基因的检测和表达
（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术．
（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交．
（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交．
（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定．如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状．

解答 解：（1）利用DNA和其它杂质在不同NaCl溶液中溶解度不同的特性，达到分离DNA的目的，根据DNA在冷酒精中凝集效果最佳，可以进一步获得含杂质较少的DNA．
（2）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生粘性末端或平末端，用同一种限制酶切割后产生的末端相同，可以直接相连．
（3）检测基因工程中目的基因表达产物，可以提取蛋白质，进行抗原抗体杂交．
（4）制备抗A抗体的杂交瘤细胞，应该用免疫的小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，一般用灭活的密病毒做诱导剂．由于细胞融合是随机的，且融合率达不到100%，所以融合的细胞除了杂交瘤细胞外，还可能有B淋巴细胞相互融合形成的细胞，骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞．
故答案为：
（1）溶解度不同 冷却酒精
（2）平  相同 
（3）蛋白质  抗原抗体杂交
（4）聚乙二醇（PEG、灭活的病毒）     B淋巴细胞相互融合形成的细胞，骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞   细胞融合是随机的，且融合率达不到100%

点评 此题较简单，要求学生对基因工程四个步骤中每个步骤中具体细节要进行充分的记忆．同时还要求学生学会读题、审题，并分析解题的能力，难度中等．