如图表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列,图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列.现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG.请回答下列问题:
(1)用图1中的外源DNA(含有目的基因D)和图2中的质粒构建重组质粒需要使用限制酶和
.前者(酶)的专一性很强,其作用特点是
.
(2)应该使用限制酶BamHⅠ同时处理质粒、外源DNA,而不选择其他3种,原因在于
.(多选) A.若使用SmaⅠ或者MspⅠ会破坏目的基因.
B.若使用SmaⅠ切割质粒,能成功切开质粒得到粘性末端的可能很低.
C.若使用MboⅠ切割质粒,质粒上会有2处被切开,会将质粒切成两段不利于筛选.
D.使用限制酶BamHⅠ能保证目的基因和质粒获得相同的粘性末端,以便目的基因和运载体定向连接,不至于反向连接.
E.使用BamHⅠ切割质粒,质粒上会有1处被切开,破坏抗生素A抗性基因,保留抗生素B抗性基因,以便于将来筛选含目的基因的受体细胞.
F.只有使用BamHⅠ切割,才能保证质粒和目的基因上产生相同的粘性末端.
(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换,那么基因D就突变为基因d.从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段,用限制酶SmaⅠ完全切割,产物中共有
种不同DNA片段.若同时用限制酶MspⅠ、MboⅠ切割图2中的质粒,则可得到
个DNA片段.
(4)为了筛选出成功导入含目的基因D的重组质粒的大肠杆菌,一般可进行如下步骤筛选:
第一步:将大肠杆菌在含
的培养基上培养,得到如图3的菌落.
第二步:再将灭菌绒布按到培养基上,使绒布面沾上菌落,然后将绒布按到含
的培养基上培养,得到如图4的结果(空圈表示与图3对照无菌落的位置).
第三步:选出图3培养皿中的某些菌落进行培养,即可得到含重组质粒的大肠杆菌.请在图3中圈出含目的基因的重组质粒的大肠杆菌的菌落
以上筛选方式至少需要两步,其实还有其他更简单的操作方法.请阅读下列材料,回答问题.
大肠杆菌pUC118质粒的某限制酶唯一酶切序列,位于该质粒的lacZ基因中.lacZ基因中如果没有插入外源基因,便可表达出β-半乳糖苷酶.当培养基中含有A物质时,A物质便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色,大肠杆菌将形成蓝色菌落;如果lacZ基因中插入了外源基因,带有pUC118质粒的大肠杆菌便不能表达β-半乳糖苷酶,培养基中的A物质不会被水解成蓝色,大肠杆菌将形成白色菌落.pUC118质粒还携带了氨苄青霉素抗性基因.如图5是利用lacZ基因筛选重组质粒示意图.
(5)用图5中的培养基中筛选导入了重组质粒的受体大肠杆菌,制备时除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外还应加入物质应包括
(多选) A.伊红美蓝试剂 B.琼脂 C.A物质 D.氨苄青霉素 E.四环素 F.噬菌体
(6)将上述处理后的大肠杆菌置于图5中培养基上培养,以检测受体大肠杆菌是否导入重组质粒,结果可能出现蓝色或者白色菌落,其中
色大肠杆菌菌落即为含重组质粒的目的菌.