发光细菌检测法在检测生物毒性的方法中具有灵敏、简便的特点而被广泛采用.
实验原理:细菌代谢正常时,发光细菌的发光强度稳定,并可维持较长时间;当外界环境影响到发光细菌代谢时,发光会立即受到抑制,且抑制程度与影响物质浓度大小呈相关关系.
实验材料:明亮发光杆菌(海水细菌)、待测海水水样、2%的NaCl溶液、3%NaCl溶液、生物毒性测试仪(用于测定细菌发光强度)、全温振荡器、试管等.
Ⅰ.发光细菌的培养
发光细菌可以直接从海水中和海鱼的体表和内脏中分离,所采用的培养基成分为:胰蛋白胨0.5%,酵母膏0.5%,甘油0.3%,KH
2PO
40.1%,Na
2HPO
40.5%,NaCI
3%,琼脂2%,pH6.5.
(1)发光细菌为
(自养型/异养型).取海鱼内脏放入灭菌培养皿中20℃培养12-18小时,在暗室中寻找发光点,用
刮取少许菌苔,在
培养基中采用
法获得纯化的发光菌株.使用前接种到
培养基中20℃下振荡培养10-12小时,增殖后用磷酸缓冲液稀释后备用.
Ⅱ.海水中重金属污染程度测定
a、配制发光菌悬液;
b、抑光反应:按照下表配置海水样品稀释液;
表1海水中重金属污染程度测定
试管编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
3%NaCl溶液(mL) |
|
4.74 |
4.49 |
4.24 |
3.99 |
海水样品(mL) |
|
0.25 |
0.50 |
0.75 |
1.00 |
发光菌悬液(mL) |
|
0.01 |
0.01 |
0.01 |
0.01 |
混合液中海水浓度(%) |
|
0.05 |
0.10 |
0.15 |
0.20 |
(2)表1中1号试管的作用是
.
(3)请在表格中填写适当的数据.
(4)利用生物毒性测试仪测定各试管的
(测定指标).
Ⅲ.五氯酚钠毒性测定
资料:五氯酚钠在水中以五氯苯酚阴离子和五氯苯酚分子平衡存在;五氯苯酚比五氯酚钠的极性小得多,更容易通过生物膜而与细菌细胞相接触.实验温度25℃下,pH为6.0、7.0、8.0、9.0时,pH每升高1个单位,分子态五氯苯酚所占的比例就下降一个数量级.
a、将五氯酚钠配成5个左右浓度等级,将接种后12h的菌液1-2mL用20-30mL3%NaCl溶液稀释混合,磁力搅拌10min 后,?取0.2mL加入比色管中,上下振荡5次,去塞,静置15min后用生物毒性测试仪测定发光强度.
b、计算相对发光率
相对发光率(RL)=测试管发光量mV/对照管发光量mV×100%
计算对应相对发光率减小50%的物质浓度(EC50)??
c.不同pH条件下,五氯酚钠毒性测定
发光细菌适宜生存的pH值为6.0-9.0
?表2 不同pΗ 值下五氯酚钠毒性测定结果/㎎?L
-1
pΗ |
6.0 |
7.0 |
8.0 |
9.0 |
EC50值 |
1.74 |
2.41 |
9.39 |
15.94 |
(5)表2的结果与结论
.
(6)据资料分析可能的原因:
.