I 已知SARS是由一种RNA病毒感染所引起的疾病。SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开展了前期研究工作。其简要的操作流程如下：

（1）实验步骤①所代表的反应过程是             。

（2）步骤②构建重组表达运载体A和重组表达运载体B必须使用限制性内切酶和

          酶，后者的作用是将用限制性内切酶切割的            和          连接起来。

（3）如果省略步骤②而将大量扩增的S基因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得到表达的S蛋白，其原因是S基因在大肠杆菌中不能              ，也不能            。

（4）为了检验步骤④所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性，可用

                与                  进行抗原―抗体特异性反应实验，从而得出结论。

II． 1958年，Meselson和Stahl通过一系列实验首次证明了DNA的半保留复制，此后科学家便开始了有关DNA复制起点数目、方向等方面的研究。试回答下列问题：

（1）由于DNA分子呈___________结构，DNA复制开始时首先必需解旋从而在复制起点位置形成复制叉（如图1）。因此，研究中可以根据复制叉的数量推测___________________。

（2）1963年Cairns将不含放射性的大肠杆菌（拟核DNA呈环状）放在含有³H-胸腺嘧啶的培养基中培养，进一步证明了DNA的半保留复制。根据右边的大肠杆菌亲代环状DNA示意图，在答题纸的相应方框内用简图表示复制一次和复制两次后形成的DNA分子。（注：以“……”表示含放射性的脱氧核苷酸链）。

（3）DNA的复制从一点开始以后是单向还是双向进行的，用不含放射性的大肠杆菌DNA放在含有³H-胸腺嘧啶的培养基中培养，给以适当的条件，让其进行复制，得到图3所示结果，这一结果说明________________。

（4）为了研究大肠杆菌DNA复制是单起点复制还是多起点复制，用第（2）题的方法，观察到的大肠杆菌DNA复制过程如图4所示，这一结果说明大肠杆菌细胞中DNA复制是            起点复制的。

7．将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。

表1   引物对序列表

表2  几种限制酶识别序列及切割位点数

请根据以上图表回答下列问题。

（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是__________。

（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？________________________________________。

（3）图1步骤3所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？                            

（4）PCR反应中由碱基错配引起的变异来源于__________。假设对一个DNA进行扩增，第一次循环时某一模板链上发生碱基错配，则扩增若干次后检测所有DNA的扩增片段与原DNA相应片段相同的是__________。

（5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。

①采用EcoRI和PstI酶切，得到__________种DNA片段。

②采用EcoRI和SmaI酶切，得到__________种DNA片段。

mtDNA是存在于人类细胞线粒体中双链闭合环状的DNA分子，具有自我复制、转录和控制合成蛋白质的功能。mtDNA的类型具有明显的种族特异性。若用两种识别切割序列完全不同的限制酶M和N切割某人的mtDNA，通过凝胶电泳分离分析得下表。限制酶M和N的识别序列和切割位点如图所示。

⑴．该mtDNA的长度为___________kb。在该DNA分子中，M酶与N酶的切割位点分别有____________个。

⑵．M酶与N酶切出的能相互粘连的末端能在______________酶的作用下相互连接，请将连接的结果表示出来：_______________________。连接后的序列是否可以用M酶、N酶进行切割，并简述理由：_________________________________________________

⑶．有人认为mtDNA能成为研究人类起源与进化的一个有力工具，请简述理由：_________________________________________________________________________ 。

下图为真核细胞的某基因的结构图以及限制酶M和N的切割位点。

⑷．现用该基因作为目的基因，若采用直接从供体细胞中分离，具体方法是：_____________。这个方法虽操作方便，但切割下的基因中含有不能指导蛋白质合成的区域。因此，目前往往采用逆转录的人工合成的方法，其基本步骤是：__________________________。

⑸．已知Ⅱ区的碱基数是2000个，其中阴影区域碱基数是800个，空白区域中G和C的总数共有400个，则由该区转录的mRNA中A和U总数是               。

（10分）mtDNA是存在于人类细胞线粒体中双链闭合环状的DNA分子，具有自我复制、转录和控制合成蛋白质的功能。mtDNA的类型具有明显的种族特异性。现用两种限制性核酸内切酶M和N切割某人的mtDNA（限制酶M和N的识别序列和切割位点如图1所示），然后通过凝胶电泳分离DNA片段（通电状态下，不同分子量的DNA片段在琼脂中的移动距离不同从而被分离），分析后得到下表。

（1）该mtDNA的长度为___________kb。在该DNA分子中，M酶与N酶的切割位点分别有____________个。

（2）M酶与N酶切出的能相互粘连的末端能在______________酶的作用下相互连接，请将连接的结果表示出来：_______________________。连接后的序列是否可以用M酶、N酶进行切割，请简述理由：________________________________________。

（3）图2为真核细胞的某基因的结构图以及限制酶M和N的切割位点。现用酶切法直接从供体细胞中切割图2中的基因从而获得目的基因，可选用酶______来切割。这个方法虽然操作方便，但切割下的基因中含有不能指导蛋白质合成的区域。因此，目前往往采用逆转录的人工合成的方法，其基本步骤是：__________________。

图2

（4）已知图2中Ⅱ区的碱基数是2000个，其中阴影区域碱基数是800个，空白区域中G 和C的总数共有400个，则由该区转录的mRNA中A和U总数是_____________。

绿色荧光蛋白GFP能在蓝光或紫外光的激发下发出荧光，这样借助GFP发出的荧光就可以跟踪蛋白质在细胞内部的移动情况，帮助推断蛋白质的功能。下图为我国首例绿色荧光蛋白（GFP）转基因克隆猪的培育过程示意图，据图回答：

（1）若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G^↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—^↓GATC—，在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点，在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来__________，理由是： ___________________________________________。

（2）过程③将重组质粒导入猪胎儿成纤维细胞时，采用最多的方法是______________________。

（3）获得转基因猪的关键步骤是_____（填序号），GFP基因的作用是作为_______。抑制小猪抗原表达的基因要插入到启动子和_________之间。获得的转基因克隆猪，可以解决的医学难题是可以避免     _____________________。

（4）目前科学家们通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白等，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是：_____________________（用数字表示）。

①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸

②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列

③蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成）  

④表达出蓝色荧光蛋白。