(一)操作步骤

　1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。

2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。

3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3-5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。

4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；(3)余下的沉淀物进行下一步骤。

5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。

6．将①、②、③涂片用l%甲苯胺兰染色后盖片即可观察。

细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。

分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。

匀浆低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。

分级分离由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。

　分析　 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。

(二)主要细胞器

1.　内质网：由膜围成一个连续的管道系统。；粗面内质网，表面附有核糖体，参与蛋白质的合成和加工；光面内质网表面没有核糖体，参与脂类合成。

2.高尔基体：由成摞的扁囊和小泡组成，与细胞的分泌活动和溶酶体的形成有关。

3.溶酶体：动物细胞中行细胞内消化作用的细胞器，含有多种酸性水解酶。

4. 线粒体：由双层膜围成的与能量代谢有关的细胞器，主要作用是通过氧化磷酸化合成ATP。

5.叶绿体：植物细胞中与光合作用有关的细胞器，由双层膜围成。

6.　细胞骨架：由微管、微丝和中间丝构成与细胞运动和维持细胞形态有关。

7.　中心粒：位于动物细胞的中心部位，故名，由相互垂直的两组9+0三联微管组成。中心粒加中心粒周物质称为中心体。

8.　微体)：由单层单位膜围成的小泡状结构，含有多种氧化酶，与分解过氧化氢和乙醛酸循环有关。

3-2-12 细胞壁的结构和功能

细胞壁是在植物细胞外层形成的一种较坚硬的结构，它包围着内部的原生质体。植物体的分生组织区如茎尖和根尖，其组成的细胞具有较强的增殖能力，所产生的新细胞一般比较小，其外层具有一圈细胞壁，称为初生细胞壁。初生细胞壁比较薄，具有一定的弹性，以适应细胞的生长。高等植物的初生细胞壁在不同植物、不同器官组织和不同发育时期，成分和结构都有很大差异，但基本组成和结构是相似的，即以纤维素微纤丝为骨架，以半纤维素和果胶以及糖蛋白为基质，通过共价键和非共价键的结合，交叉形成一种高度复杂的、抗张力强的网状结构。细胞壁中存在多种酶，如过氧化物酶、磷酸酯酶、苹果酸脱氢酶等，在衰老和果实成熟时，还产生自溶酶，如纤维素酶、果胶酶等。

随着细胞的分化，植物体产生各类具有特殊功能的细胞、组织和器官，为适应其特殊生理功能的需要，其细胞壁也发生各种不同的次生修饰，如木质部中的导管和管胞，以及纤维和木纤维细胞的细胞壁都发生次生加厚。

植物细胞壁的形成，首先对细胞具有保护作用，还由于细胞壁具有较坚韧的支撑性，因此它对植物体起着骨架作用。细胞壁虽是细胞外层的一种坚韧的结构，但它并未将相邻细胞完全隔离，细胞间存在着一种穿过细胞壁的特殊结构，即胞间连丝，它使细胞间能进行物质和信息的交流。同时细胞壁还具有运输功能。特化的细胞一般都产生具有某种相应功能的细胞壁。

3-2-13 细胞器的分离提出方法

细胞中的膜结构是整个细胞及多种细胞器的界膜，对于保持细胞和细胞器的独立性是必不可少的，同时很多重要的功能是在膜结构上完成的。为了研究细胞膜和细胞器的结构与功能，首先要分离出形态与结构完整的、具有生物活性的、纯度高的样品。在研究工作中，分离细胞膜和细胞器可以用以下方法。

首先是制备一定量的细胞，细胞的来源可以是培养细胞，也可以是某种组织。培养细胞的收集相对简单一些，直接用胰酶将细胞从培养瓶上消化下来，制成细胞悬浮液。比较易碎的组织细胞的收集如肝、脾等，可采用匀浆的方法，稍加研磨就可制成细胞悬液。有些结缔组织，直接研磨不易分离出细胞，可先用适量的胶原酶处理。

细胞制备出来后，进行匀浆处理。匀浆的方法有多种，如用高速打碎机破碎，低渗，玻璃珠与细胞共振荡，冻融法，超声波打碎等。可根据实验需要和实验室条件来选择。无论选择哪种方法，都要尽可能保持膜的完整性。整个操作过程要避免过于激烈，pH、离子强度和渗透压等条件要适中，一般常用中性和等渗溶液。

匀浆产生的细胞裂解物，可通过一系列差速离心再加上一个梯度离心来分离细胞膜与细胞器，梯度是根据细胞器的大小、密度和沉降特性来设计的。匀浆分步分离的第一步是差速离心，在一系列的离心过程中离心力逐渐加大，并且将细胞器加入到具有密度梯度的介质中离心，常用的分离介质有蔗糖、甘油、葡聚糖等。由于每种细胞器的大小和沉降特性不同，因此可被分离出来。如果只是分离细胞中的某种细胞器，可直接根据那种细胞器所对应的相对离心力，在细胞匀浆后进行离心分离。哺乳动物红细胞的结构比较简单，其细胞膜可用低渗离心的方法分离出来。如果是独特的细胞膜，可根据表面电荷的密度采用电泳的方法分离，也可根据大小采用凝胶过滤的方法分离。

3-2-14 细胞膜成分与分析方法

组成细胞膜的成分可分为三大类，即膜脂、膜蛋白和糖类。几种成分所占的比例，依据膜类型的不同，细胞类型的不同，生物类型的不同以及细胞不同的发育时期而发生变化，如肝细胞膜中蛋白质与脂质的比例明显高于红细胞。

膜脂是细胞膜的基本成分，约占膜成分的50%，它又包括三大类脂质分子，即磷脂、糖脂和胆固醇。磷脂含有极性的磷酸基团，以及非极性的烃链，即包括极性的头部和非极性的尾部，属双型性分子。糖脂也是双型性分子，它的结构与鞘磷脂很相似，仅由一个或多个糖基代替了磷脂酰胆碱。胆固醇分子包括三部分：作为极性头部的羟基、类固醇环和一个非极性的碳氢尾部。

膜蛋白是构成细胞膜的重要组分，膜的大部分功能主要由膜蛋白完成。膜蛋白约占膜成分的40%。根据膜蛋白与膜脂的结合方式，膜蛋白可分为内在蛋白(或称跨膜蛋白)和外周蛋白。

膜中的糖类约占膜成分的2%-10%，它们通常与膜脂结合形成糖脂，或与蛋白结合形成糖蛋白。其中的糖类分子有单糖，也有多糖。

对于组成细胞膜的基本成分，最初是通过用脂质溶剂和蛋白酶处理细胞膜来确定的。用脂质溶剂处理细胞，发现细胞膜被溶解，脂质分子进入到溶剂中，说明膜中含有脂质分子；用蛋白酶处理细胞也能破坏膜结构，说明细胞膜的化学组成中除了脂质还有蛋白质。对于一些具体的组成成分，可采用相应酶的处理来确定。例如，用卵磷脂酶处理细胞，可破坏细胞膜，证明膜中有卵磷脂的存在。对于膜中某种蛋白质功能的分析，有很多方法，其中一种是将这种蛋白质分离纯化出来，将它掺入到磷脂小泡中，形成只含一种蛋白质的磷脂小泡，然后检测蛋白质的功能。

3-2-15 细胞核与线粒体的分级分离

(一)细胞质基质的功能：

1、具有较大的缓冲容量，为细胞内各类生化反应的正常进行提供了相对稳定的离子环境。

2、多代谢过程是在细胞基质中完成的，如①蛋白质的合成、②核酸的合成、③脂肪酸合成、④糖酵解、⑤磷酸戊糖途径、⑥糖原代谢、⑦信号转导。

3、供给细胞器行使其功能所需要的一切底物。

4、细胞骨架参与维持细胞形态，做为细胞器和酶的附着点，并与细胞运动、物质运输和信号转导有关。

5、控制基因的表达与细胞核一起参与细胞的分化，如卵母细胞中不同的mRNA定位于细胞质不同部位，卵裂是不均等的。

6、参与蛋白质的合成、加工、运输、选择性降解。

存在于质膜与核被膜之间的原生质称为细胞质，细胞之中具有可辨认形态和能够完成特定功能的结构叫做细胞器。除细胞器外，细胞质的其余部分称为细胞质基质或胞质溶胶，其体积约占细胞质的一半。细胞质基质并不是均一的溶胶结构，其中还含有由微管、微丝和中间纤维组成的细胞骨架结构。

细胞核是细胞内最重要的细胞器，核表面是由双层膜构成的核被膜，核内包含有由DNA和蛋白质构成的染色体。间期染色体结构疏松，称为染色质；有丝分裂过程中染色体凝缩变短，称为染色体。其实染色质与染色体只是同一物质在不同细胞周期的表现。染色体的数目因物种而异，有的如蕨类植物的染色体数多达1260个；有的如马蛔虫只有两条染色体。核内1至数个小球形结构，称为核仁。

细胞表面的一层单位膜，特称为质膜。真核细胞除了具有质膜、核膜外，发达的细胞内膜形成了许多功能区隔。由膜围成的各种细胞器，如核膜、内质网、高尔基体、线粒体、叶绿体、溶酶体等。在结构上形成了一个连续的体系，称为内膜系统。内膜系统将细胞质分隔成不同的区域，即所谓的区隔化。区隔化是细胞的高等性状，它不仅使细胞内表面积增加了数十倍，各种生化反应能够有条不紊地进行，而且细胞代谢能力也比原核细胞大为提高。

(五)比较两组概念

1．　 原生质和原生质层

2．　 细胞膜的流动性和选择透过性

达标训练

1．一个成熟的植物细胞，它的原生质层主要包括：( )

　A．细胞膜、核膜和这两层膜之间的细胞质

B．细胞膜、液泡膜和这两层膜之间的细胞质

C．细胞壁、液泡膜和这两层膜之间的细胞质

D．细胞膜、液泡膜之间的细胞质

2．在一个新鲜萝卜中挖一凹槽，在凹槽中放进浓盐水，过一段时间，结果是：

　A．萝卜变硬，凹槽中水分减少　 B．萝卜变硬，凹槽中水分增多

C．萝卜变软，凹槽中水分减少　 D．萝卜变软，凹槽中水分增多

3．`浓盐水有杀菌防腐作用，其原因： ( )

　A．食盐水中含有较多的CL^-，使细菌毒素失效

B．食盐水中含养料少，细菌迅速死亡

C．食盐水中含无菌类所需要的氨基酸，细胞不能产生毒素

D．由于渗透作用，使细胞死亡

(四)无机盐的存在形式与功能　

1．存在形式：通过主动运输吸收的无机盐，主要以　　　存在，也有一部分以　　的形式存在。

2．功能：作为细胞的　　　；

对细胞　　　的进行具有重要的调节作用。

　小结：通过　　　和　　　，细胞获得了自身　　　　，

排出了　　和　　　。

(三)细胞膜的功能特点――选择透过性

　　　　、　　　　　和　　可以通过，

　　其他的　　、　　及　　　　不能通过。