目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。

（1）建构基因表达载体时，必须有               、复制原点、目的基因、终止子以及                                    。

（2）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于                    。

（3）pBR322分子中有单个EcoRI限制酶作用位点，EcoRl只能识别序列—GAATTC一，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRl的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRI切割后所形成的黏性末端                   。

（4）pBR322分子中另有单个的BamHI限制酶作用位点，现将经BamHI处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复         ，成功获得了重组质粒。说明                         。

（5）为了检测上述重组质粒是否导入原本无amp^R和tet^R的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落；再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是            。图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是                 。

（11分）目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。

(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于________。观察上图，如果A为质粒，则C表示       。
(2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。
_______________________________________________________________________
(3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过____________作用恢复________________________键，成功地获得了重组质粒。能形成重组质粒的原因是_______________________________________________________________________
(4) 作为受体大肠杆菌应不含_______________________，以方便筛选已导入重组质粒的受体大肠杆菌。将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是_______，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是______________。
（5）基因工程中使用的限制酶，其特点是_______________________，下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四环素的抗性基因。

将两端用E1切开的Tcr基因与用E1切开的质粒X－1混合连接，连接后获得的质粒类型有＿＿＿。（可多选）

（17分）基因工程又叫基因拼接技术。
（1）在基因工程技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以目的基因转录的      为模板，  　  成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成目的基因。
（2）基因工中常用的受体细胞有细菌、真菌、 　　　　 。
（3）在基因工程技术中，DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 　　　　 和  　　　 。
（4）大肠杆菌质粒经EcoRI（一种限制性核酸内切酶）切割后所形成的黏性末端之一是 ，则EcoRI的识别序列和切点是_____________________（切点用箭头标在序列上）。
（5）将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，约80%的转基因植物都是通过这种方法获得。除此法之外，还有____________和____________等。
（6）聚合酶链式反应（PCR技术）是在实验室中以少量样品DNA制备大量DNA的生化技术.某个DNA样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则经过PCR仪五次循环后，将产生    个DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是          个。请指出PCR技术与转录过程的二个不同之处：
①                                                                 。
②                                                                 。
（7）一个基因表达载体的组成，除了目的基因之外，还必须有     ，      以
及            。
（8）在目的基因的监测与鉴定工作中，又是需监测目的基因是否翻译成蛋白质，监测的方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行            杂交，若有          出现，表面目的基因已经形成蛋白质产品。

基因工程常用土壤农杆菌Ti质粒作为载体，需把目的基因插入Ti质粒的T-DNA才能整合到植物染色体DNA上。下图表示抗虫棉培育中使用的三种限制酶A.B.C的识别序列以及Ti质粒上限制酶切割位点的分布，抗虫基因内部不含切割位点，两侧标明序列为切割区域。下列叙述错误的是

A.应该使用酶B和酶C切取抗虫基因

B.应该使用酶A和酶B切割Ti质粒

C.成功建构的重组质粒含1个酶A的识别位点

D.成功建构的重组质粒用酶C处理将得到2个DNA片段

基因工程相关。2008年诺贝尔化学奖授予了三位在研究绿色荧光蛋白（GFP）方面做出突出贡献的科学家。绿色荧光蛋白能在蓝光或紫外光的激发下发出荧光，这样借助GFP发出的荧光就可以跟踪蛋白质在细胞内部的移动情况，帮助推断蛋白质的功能。下图为我国首例绿色荧光蛋白（GFP）转基因克隆猪的培育过程示意图，据图回答：

注：图中通过过程①、②形成重组质粒，需要限制性内切酶切取目的基因、切割质粒。限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G^↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—^↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。

  （1）在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来        ，理由是：                                          。

  （2）过程③将重组质粒导入猪胎儿成纤维细胞时，采用最多的方法是              。

  （3）如果将切取的GFP基因与抑制小猪抗原表达的基因一起构建到载体上，GFP基因可以作为基因表达载体上的标记基因，其作用是               。获得的转基因克隆猪，可以解决的医学难题是，可以避免           。

  （4）目前科学家们通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白等，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是：          （用数字表示）。①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列③蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成）④表达出蓝色荧光蛋白。