35．小鼠基因敲除技术2007年获诺贝尔奖.80年代初胚胎干细胞的分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础.87年Thompsson首次建立了完整的ESC基因敲除技术的模型.此后几年中基因敲除技术得到了进一步的发展和完善.其技术路线如下. ①胚胎干细胞的获得, ②构建重组基因表达载体, ③用一定方法把重组DNA转入受体细胞内, ④用一定培养基筛选已击中的细胞, ⑤将击中的细胞转入胚胎.通过胚胎移植使其生长为转基因动物.然后对该动物进行形态观察和分子生物学检测. 异源抗体用于人体容易发生排异反应.若将动物抗体分子基因敲除.代之以人的抗体分子基因.那么人源抗体的产生将迎刃而解.根据上述材料回答下列问题: (1)构建重组载体过程中.为使导人的目的基因能完成表达.需要在目的基因的首端和尾端各插入 , (2)上述过程中所需的胚胎通常通过供体获得.再将处理过的胚胎移植到受体内培养.则胚胎移植前要对供体和受体进行 处理.若想培养出多个性状表现一致的个体.可通过 技术, (3)应用基因敲除技术可让动物生产人源抗体.通常可将从动物体内提取的细胞的抗体分子基因敲除.代之以人的抗体分子基因.然后将该细胞通过细胞融合技术与骨髓瘤细胞融合.再通过 . 等过程筛选出能产生人源抗体的细胞群.再在培养液或小鼠腹腔进行培养.从而获得所需抗体, (4)用培养基筛选重组载体是否已击中细胞.方法之一是启动子缺失筛选法:原理是在重组载体的目的片段中插入一个启动子缺失的正向选择基因.同时目的基因片段也不包含该基因的启动子序列.若基因载体和细胞基因组发生同源重组.则正向选择基因可以在靶位点基因启动子的作用下得以表达.使阳性细胞具有G418抗性(G418是一种细胞毒性药物.对细胞有抑制或杀伤作用).从而从培养基中得到所需要的阳性克隆细胞.根据上述原理筛选导人成功的细胞的基本方法或过程是 . 【
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