9．(2014年上海奉贤区模拟)下图表示培育能产生人生长激素的工程菌的基本过程。图中pBR322是大肠杆菌的一种质粒，Amp^r表示氨苄青霉素抗性基因，Tet^r表示四环素抗性基因；BamHⅠ位点是BamHⅠ限制酶的切割位点；A、B是含有特定抗生素的培养基。目的基因如果插入某抗性基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性。为了筛选出运载体导入原本没有Amp^r和Tet^r的大肠杆菌(受体细胞)，首先将大肠杆菌培养在通用培养基上，再将其菌落原位转移到A、B培养基上培养(如图中④)，得到如图结果：黑点表示菌落，A中空圈表示B的菌落在A中不能生长的位置。据此分析并回答：

(1)“pBR322”的化学本质是________，在自然情况下可通过________过程进行扩增。

(2)图中过程①表示的获得目的基因的方法是________，过程②中DNA连接酶的作用是________________________________________________________________________。

过程③是________。

(3)根据用途，右图中A、B所用培养基属于________。所需大肠杆菌的菌落位于________(填“A”或“B”)上，理由是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(4)基因工程的理论基础是中心法则，根据右图遗传信息表达可用公式(图解)表示为________________________________________________________________________。

解析：本题考查基因工程获得转基因工程菌的过程和对工程菌的选择。(1)pBR322是大肠杆菌的一种质粒，质粒是细菌细胞内的一种小型的环状DNA分子，因此化学本质是DNA分子。质粒的特点之一就是能自我复制，通过复制进行扩增。(2)获取目的基因的方法有两种：一种是从生物材料中获取，另一种是人工合成，左图中表示的是用限制酶切割外源基因获得目的基因，属于从生物材料中获取目的基因。DNA连接酶的作用是将目的基因与运载体结合构建基因表达载体。图中③是将重组质粒导入受体细胞的过程。(3)A、B两个培养基分别含有四环素和氨苄青霉素，分别筛选抗四环素的大肠杆菌和抗氨苄青霉素的大肠杆菌。从左图分析，四环素抗性基因被破坏，重组质粒中标记基因只有结构完整的氨苄青霉素基因，在B中能存活说明含有抗氨苄青霉素的基因，说明大肠杆菌导入了重组质粒。(4)基因工程中基因的复制、转录和翻译都要依据中心法则，右图包括复制、转录和翻译过程，遗传信息的表达只包括转录和翻译过程。

答案：(1)DNA　自我复制　(2)从生物体细胞中分离　将目的基因与运载体结合形成重组DNA　将重组质粒导入受体细胞　(3)选择培养基　B　导入目的基因后四环素抗性基因被破坏，重组质粒中应该只含氨苄青霉素抗性基因，所以能在B上存活但不能在A上存活的大肠杆菌，说明含有重组质粒(答案合理即可)　(4)DNARNA蛋白质

8．转基因生物可作为生物反应器，用来生产人们所需的药用蛋白，如激素、抗体、疫苗、酶等，甲图是通过生物工程培育能产生人胰岛素的烟草的过程。

(1)构建表达载体的A过程中，可选用不同限制酶，如乙图所示过程，采用EcoRⅠ和EcoRV酶切含有目的基因的DNA和质粒，这样可以防止酶切产物在加入DNA连接酶后，出现________________________________________________________________________；

若在图中只使用一种DNA连接酶，应选用________(填“E·coliDNA连接酶”或“T₄ DNA连接酶”)。

(2)D过程采用的方法是________，如受体细胞是单子叶植物体细胞一般不采用该方法，原因是________________________________________________________________________；

E过程体现的生物学原理是________。

(3)如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测，F过程应该用________________________________________________________________________作为探针。

解析：(1)用不同的限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因，形成的黏性末端不同，再用DNA连接酶连接，可以防止质粒和含目的基因的外源DNA自身环化。若在图中只使用一种DNA连接酶，应选用T₄DNA连接酶，因为T₄DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端。(2)图中目的基因导入植物细胞用的是农杆菌转化法。受体细胞若是单子叶植物体细胞一般不采用农杆菌转化法，因为大多数农杆菌对单子叶植物没有感染能力。植物组织培养的理论基础是细胞的全能性。(3)检测目的基因是否导入受体细胞时，应用放射性同位素标记的人胰岛素基因作探针。

答案：(1)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化　T₄DNA连接酶　(2)农杆菌转化法　单子叶植物伤口处细胞不分泌酚类物质，不能吸引农杆菌移向这些细胞(或大多数农杆菌对单子叶植物没有感染能力)　细胞全能性　(3)放射性同位素标记的人胰岛素基因

7．下图为利用农杆菌转化法培育转基因抗虫棉的技术流程图。请据图回答：

(1)图中A为________，在构建该结构时，Bt毒蛋白基因与Ti质粒结合的部位是________。

(2)①过程是________________，利用农杆菌的优点在于________________。

(3)③过程为________，包括________和________过程。

解析：基因表达载体的构建是基因工程的核心内容。质粒上插入目的基因的位置是在T?DNA片段内。农杆菌可以感染受伤的植物细胞，通过基因转化把T?DNA上的外源基因导入植物细胞并整合到受体细胞核基因组上。植物组织培养主要包括脱分化和再分化两个过程。

答案：(1)基因表达载体　T?DNA片段内

(2)将基因表达载体转移到农杆菌细胞内　农杆菌可以感染受伤的植物细胞，通过基因转化把T?DNA上的外源基因导入植物细胞并整合到受体细胞核基因上

(3)植物组织培养　脱分化　再分化

6．下图是利用基因工程方法培育抗虫棉的过程。请回答相关问题：

(1)从苏云金芽孢杆菌的DNA上获取抗虫基因，需要用到的工具是________，此工具主要是从________生物中分离纯化出来的，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的________键断开。

(2)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有________，它能把目的基因整合到受体细胞________。

(3)E过程是利用________技术完成的，要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做________实验。

(4)将目的基因导入植物细胞，除采用上图中的方法外，还可采用________法和花粉管通道法。

解析：(1)限制酶用于切割DNA分子，获取目的基因。限制酶主要从原核生物细胞中获取。限制酶可断开磷酸二酯键，将DNA分子切开。(2)Ti质粒可将T?DNA整合到植物细胞的染色体DNA上，故将目的基因借助Ti质粒导入植物细胞中。(3)E过程利用了植物组织培养技术。可把害虫接种到转基因植株上，以检测转基因植株的抗虫基因是否正常表达。

答案：(1)限制酶　原核　磷酸二酯

(2)T?DNA　染色体DNA

(3)植物组织培养　抗虫的接种

(4)基因枪

二、非选择题

5．(2014年潍坊联考)为提高我国稻米的含铁量，通过农杆菌介导将菜豆的铁结合蛋白基因导入了一个高产粳稻品种中。获得了高含铁量转基因水稻株系，下图为培育过程。请分析并回答问题：

(1)获取重组载体用到的“手术刀”是________________________________________________________________________。

②过程用________法将重组载体导入愈伤组织细胞。

(2)重组载体中的标记基因的作用是________。检测目的基因是否转录，需用________作探针。

(3)图中①③④过程须在________条件下进行，培养基中除加入营养物质外，还需添加植物激素，作用是________。

(4)过程④除了用秋水仙素或低温诱导来处理，还可以采用________技术，该技术常用的诱导剂是________。

解析：将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，检测目的基因的转录，常用分子杂交的方法，基因探针就是用同位素标记的目的基因，该题的目的基因是铁结合蛋白基因。①③④过程是植物组织培养须在无菌条件下进行，培养基中的植物激素主要是生长素和细胞分裂素，主要用于促进细胞的生长和分化，通过植物体细胞杂交技术可以培育多倍体，常用聚乙二醇作诱导剂，也可以用离心、振动、电刺激等物理手段诱导。

答案：(1)限制性核酸内切酶　农杆菌转化

(2)检测目的基因是否导入受体细胞　同位素标记的铁结合蛋白基因

(3)无菌　促进细胞分裂、生长、分化

(4)植物体细胞杂交　聚乙二醇

4．天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是(　)

A．提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再扩增基因B

B．利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B

C．利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞

D．将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞

解析：此题考查基因工程及其应用的相关知识。获取目的基因B，可先提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再经PCR技术扩增，A正确；基因文库构建时是将目的基因与载体连接起来，形成重组载体，再导入受体菌中储存和扩增，提取目的基因时不需使用限制酶，B错误；连接目的基因与质粒的酶是DNA连接酶，C错误；将目的基因导入植物细胞，常用农杆菌转化法，不使用大肠杆菌，D错误。

答案：A

3．(2013年高考江苏卷)(多选)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是(　)

A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列

B．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列

C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶

D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞

解析：利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列设计引物，但不需知道目的基因的全部序列，需要考虑载体的序列；因PCR反应在高温条件下进行，故反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶；因某些目的基因编码的产物需经特殊的加工修饰过程。故一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞。

答案：BD

2．(2013年高考大纲卷)下列实践活动包含基因工程技术的是(　)

A．水稻F₁花药经培养和染色体加倍，获得基因型纯合新品种

B．抗虫小麦与矮秆小麦杂交，通过基因重组获得抗虫矮秆小麦

C．将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞，经组织培养获得抗病植株

D．用射线照射大豆使其基因结构发生改变，获得种子性状发生变异的大豆

解析：本题考查遗传、变异等基础知识在生产中的应用。A项属于单倍体育种，原理是染色体变异，不包含基因工程技术；B项属于杂交育种，原理是基因重组，不包含基因工程技术；C项中将含有目的基因的重组DNA导入受体细胞，属于基因工程，原理是基因重组；D项属于诱变育种，原理是基因突变，不包含基因工程技术。

答案：C

一、选择题

1．2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白”的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是(　)

A．追踪目的基因在细胞内的复制过程

B．追踪目的基因插入到染色体上的位置

C．追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布

D．追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构

解析：将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质带有绿色荧光，从而可以追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布。

答案：C

4．(2012年高考福建卷)肺细胞中的let－7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let－7基因导入肺癌细胞实现表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图1。

图1

图2

请回答：

(1)进行过程①时，需用________酶切开载体以插入let－7基因。载体应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动let－7基因转录，该部位称为________。

(2)进行过程②时，需用________酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于传代培养。

(3)研究发现，let－7基因能影响癌基因RAS的表达，其影响机理如图2。据图分析，可从细胞中提取______进行分子杂交，以直接检测let－7基因是否转录。肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞中________________________________________________________________________

(RAS mRNA/RAS蛋白)含量减少引起的。

解析：此题考查基因工程应用的相关知识。(1)构建基因表达载体时，需要用同种限制酶切割目的基因和载体，使之产生相同的黏性末端。载体应有启动子、终止子和标记基因，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录。(2)动物细胞培养时，常用胰蛋白酶处理贴壁的细胞，使之相互分离，以利于传代培养。(3)检验目的基因是否表达，常用分子杂交法。从被导入目的基因的细胞内提取RNA，与目的基因单链杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已转录。由图2知，当let－7基因转录出来的miRNA与癌基因RAS转录出的mRNA杂交时，就会抑制RAS蛋白的产生，故肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞中RAS蛋白含量减少引起的。

答案：(1)限制性核酸内切(或限制)　启动子

(2)胰蛋白　(3)RNA　RAS蛋白

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