3．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入10%酚可以抑制细菌和霉菌。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出　(多选)

A．大肠杆菌　　　　 B．霉菌　　　　　　 C．放线菌　　　　 D．固氮细菌

2．下列说法不正确的是(　　 )

A．科学家从70-80℃热泉中分离得到耐高温的TaqDNA聚合酶

B．统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数估计值

C．设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度

D．同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多

1．下列可以作为自养微生物氮源的是

A． N₂、尿素　　　　 B．牛肉膏、蛋白胨

C．尿素、酵母粉　　　 D．铵盐、硝酸盐

(四)分离分解纤维素的微生物的实验案例

土壤中纤维素分解菌的分离实验的具体操作步骤如下。

1.土样采集

土样采集的方法与本专题课题2类似。土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。

2.选择培养

选择培养需要的仪器有：250mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1mL和10mL的移液管、天平、摇床、温度计等。

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在250mL锥形瓶中装入30mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸(或报纸)，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

选择培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1-2d，至培养基变混浊。此时可以吸取0.1mL培养液进行梯度稀释和涂布平板，也可以按课本中所述，重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。

3.刚果红染色法分离

纤维素分解菌这一步所需要的仪器有：无菌培养皿、涂布器、1mL移液管，装有9mL无菌水的20mL大试管，温箱等。

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500mL三角瓶中装入200mL培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15-20mL培养基，凝固后待用。

制备菌悬液：按照本专题课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数至106。

涂布平板：将稀释度为104-106的菌悬液各取0.1mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在30℃倒置培养，至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。刚果红染色的具体操作步骤参照课本［资料三］。

总结提高

　

1．微生物的实验室培养的有关总结

(1)生物的营养

营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。

人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。

植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类。

微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。

(2)确定培养基制作是否合格的方法

将未接种的培养基在恒温箱中保温1-2天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

(3)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？

无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。

2. 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的有关总结

(1)选择培养基

选择培养基的含义是：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。

在培养基中加入某种化学物质可以做到这一点，如加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在培养的培养成分的基础上加入的。

培养基中的营养成分的改变也可达到分离微生物的目的。如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。改变微生物的培养条件， 也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。

(2)如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。

(3)中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？

这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/Kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧型细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

疑点解答

　

1．如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。

2．为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？

这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

3．为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？

由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

4．将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？

将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。

5．两种刚果红染色法的比较

刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

6．为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。

7．分离分解纤维素的微生物的实验流程与稀释液的取样培养流程图有何异同？

它们的区别是：稀释液的取样流程图是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。分离分解纤维素的微生物的实验流程通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本相同。

8．将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？

将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌的生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。

9．两种刚果红染色法的比较

刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂的问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

10．为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。

名师点睛

　

1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是

A．在液体培养基上进行　　　　　　　 B．至少接种一种细菌　　　

C．接种一个细菌　　　　　　　　　　 D．及时补充消耗的营养物质

答案：A

解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。

2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是

A．调整期　　　 B．对数期　　　 C．稳定期　　　　 D．衰亡期

答案：C

解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。

3．温度对发酵过程的影响，不正确的是

A．温度过高，发酵周期缩短，产量降低　　　　 B．温度不影响生物合成的途径

C．温度能影响菌种对营养物质的吸收　　　

D．菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同

答案：B

解析：解答此题需要从以下几方面入手分析：第一，发酵过程需要适宜的温度，如果温度过高，酶很快失活，菌体衰老，发酵周期就会缩短，产量也会降低；第二，温度能影响生物合成的途径，这是因为生物合成过程需要酶，酶的活性与温度高低有关；第三，菌种吸收营养物质一部分是通过主动运输来完成的，需呼吸作用提供能量，这与温度有关；第四，菌体生长和产物合成需体内旺盛的代谢作基础，而用于生长繁殖和代谢产物生成的酶不同，因此所需的最适宜的温度也不一定相同。

4．(2008全国Ⅰ卷，理综，3)下列关于细菌的叙述，错误的是(　 )

A．硝化细菌能以NH₃作为氮源和能源物质

B．某些细菌可以利用光能因定CO₂合成有机物

C．生长因子是某些细菌生长过程中需要额外补充的营养物质

D．含伊红和美蓝试剂的培养基不能用来签别牛奶中的大肠杆菌

答案：D

解析：某些细菌如蓝细菌(蓝藻)、光合细菌以及红螺菌都能进行光合作用。生长因子是指微生物生长不可缺少的微量有机物，主要包括维生素、氨基酸和碱基等。而微生物的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源和生长因子，它们都是要从外界获得补充的。常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌，如果有大肠杆菌，则菌落呈黑色。

5．抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。

⑴青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是　　 ，青霉素是青霉菌的　　　　 代谢产物。

⑵在生产和科研中，常选用处于　　　　 期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，　　　　　　 和　　　　　　　　 比较稳定。

⑶对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，　　　　 ，再计算发酵罐中菌体的总重量。

答案：⑴异养需氧型 　　次级　 ⑵对数　 个体的形态生理特性　　 ⑶称菌体的湿重(称烘干后的重量)

解析：青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型，而青霉素作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产物。在测定培养基上青霉菌菌体的生长情况时，常用的方法有两种：一种是测量青霉菌的细胞数目，另一种是测重量，取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此计算出其中的细胞总重量。在细菌生长的四个主要时期中，因为处于对数期的细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种和科研的材料。

6．某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如下图所示。请分析回答问题：

⑴培养基中加入化合物A的目的是筛选　　　　 ，这种培养基属于　　　　　 培养基。

⑵“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的　　　　　 ，实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是　　　　　　 。

⑶培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量　　　　　 的培养液，接入新的培养液中连续培养，使“目的菌”的数量　　　　　　　 。

⑷转为固体培养时，常采用　　　　　　　 的方法接种，获得单菌落后继续筛选。

⑸若研究“目的菌”的生长规律，将单个菌落进行液体培养，可采用　　　　　　　 的方法进行计数，以时间为横坐标，以　　　　　 为纵坐标，绘制生长曲线。

⑹实验结束时，使用过的培养基应该进行　　　　　 处理后，才能倒掉。

答案： ⑴目的菌　　　 选择　　 ⑵化合物A　　 异养需氧型　　 ⑶减少　　 增加　 ⑷划线　 ⑸定期取样“目的菌”数目的对数　　 ⑹灭菌

解析：题干中首先说明了A是有机物，后来在培养基中双增加了磷酸盐、镁盐以及微量元素，通过比较各培养瓶中A的多少，选出“目的菌”，由此还可推断出“目的菌”所需碳源和氮源来自A，是异养型。获得“目的菌”种后，选进行扩大培养，培养过程中及培养结束后注意灭菌。

4、单元测试题目

(三)分离分解纤维素的微生物的实验流程

　　 土壤取样→选择培养(此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定)→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落

(1)土壤采集

选择富含纤维素的环境。

(2)刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤

倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板

(3)刚果红染色法种类

一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。

(二)纤维素分解菌的筛选

(1)筛选方法

刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。

(2)刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理

刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

(一)纤维素与纤维素酶

(1)棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

(2)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。

(五)实验案例

土壤中某样品细菌的分离与计数。实验的具体操作步骤如下。

1.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

2.制备培养基

准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103-107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。

3.微生物的培养与观察

参考课本中图2-7的实验流程示意图，将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中(锥形瓶体积为250mL)，充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107-103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。

4.细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在30-300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

(四)实验设计

实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。

(1)土壤取样

从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3-8cm的土壤层取样。

(2)制备培养基

准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

(3)微生物的培养与观察

将土样以1、101、102……依次等比稀释至107稀释度，按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。注明培养基种类、培养日期以及平板培养样品的稀释度。将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

(4)细菌的计数

当菌落数目稳定时，进行计数，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。求出平均值，根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

(三)设置对照

　　 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。