0  384517  384525  384531  384535  384541  384543  384547  384553  384555  384561  384567  384571  384573  384577  384583  384585  384591  384595  384597  384601  384603  384607  384609  384611  384612  384613  384615  384616  384617  384619  384621  384625  384627  384631  384633  384637  384643  384645  384651  384655  384657  384661  384667  384673  384675  384681  384685  384687  384693  384697  384703  384711  447090 

例1 利用凝胶色谱法,什么样的蛋白质先洗脱出来(  )

A.相对分子质量大的

B.溶解度高的

C.相对分子量小的

D.所代电荷多的

解析:凝集色谱法使根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道,路程较长,移动速度较慢;相对分子质量大的蛋白质,路程较短,移动速度较快,首先洗脱出来。

答案:A

例2 蛋白质提取和分离分为哪几步(  )

A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

解析:蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术

答案:C

☆综合应用

例3用凝胶色谱法分离蛋白质时,分子量大的蛋白质(  )

A路程较长,移动速度较慢    B路程较长,移动速度较快

C路程较短,移动速度较慢    D路程较短,移动速度较快

解析:在小球体内部有许多贯穿的通道,当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢;而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。

答案:D

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2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢?。

透析。半透膜的选择透过性,大分子物质不能通过半透膜,离子和小分子能够通过半透膜。

在透析过程中,血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH=7的磷酸缓冲液中。

思考:为何使用pH=7的磷酸缓冲液?为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量?

维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。

总结:通过以上四个基本过程,红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子(如呼吸酶等)。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢?我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――粗分离(凝胶色谱操作)。

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2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为:洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么?

除去血浆蛋白的杂蛋白,有利于后续步骤的分离纯化。

红细胞的洗涤过程为

血液+柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞+5倍体积生理盐水 →缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

思考:加入柠檬酸钠有何目的?为什么要低速、短时离心?为什么要缓慢搅拌?

防止血液凝固;防止白细胞沉淀;防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

思考:你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来?

加入蒸馏水,用玻璃棒快速搅拌一段时间。

补充:加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜,有利于血红蛋白的释放和分离。此时,红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白,而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢?由于它们的密度不同,科学家采取了离心分离的方法:

红细胞破碎混合液→中速长时离心(2000c/min×10min)→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白

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2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤?

样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

思考:是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的?为什么?

不是。因为蛋白质的来源和性质不同,分离方法差别很大。

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2.实验设计

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1.2缓冲溶液

(1)原理:由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成(如H2CO3-NaHCO3,HC-NaC,NaH2PO4/Na2HPO4等),调节酸和盐的用量,可配制不同pH的缓冲液。

(2)缓冲液作用:抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

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1.1凝胶色谱法(分配色谱法):

(1)原理:(见课件图) 分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙,路程短,流动快;分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部,路程长,流动慢。

(2)凝胶材料:多孔性,多糖类化合物,如葡聚糖、琼脂糖。

 

(3)分离过程:

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

*洗脱:从色谱柱上端不断注入缓冲液,促使蛋白质分子的差速流动。

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同步练习册答案